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红外光谱在中药当归质量研究中的应用

 
 
传统的中药鉴别方法以经验法、显微法和理化鉴别为主, 其中经验法具有主观性和片面性, 而显微法和理化鉴别法需对样品进行复杂处理、耗时较长, 且显现的是中药材中单一成分或部分成分的信息。常规定量分析时所用的高效液相色谱法、气相色谱法均具有预处理繁琐、分析过程复杂、实际操作性差等缺点。而红外光谱技术应用于中药材定性定量分析具有快速、简便、无损等优点, 且能够反映药材的整体特征。孙素琴团队创立了“多级红外光谱宏观指纹分析法”, 即红外光谱三级鉴定法, 包括3个步骤, 首先是采集各种样品的红外光谱图, 建立相应图谱分类数据库, 将被测样本与已知谱图进行比对, 按其相关性进行分析与鉴定, 称为一级鉴定。倘若相关性不足以作出确切的判断时, 则需要采用高分辨的二阶导数谱, 进行样本和对应已知图谱的比对分析, 按其相关性的量化值加以鉴定。倘若这两级分析仍未能作出准确的判断时, 则需采用二维相关光谱图进行第三级鉴定。结合基于红外光谱的模式识别和多元校正等化学计量学方法, 既可以对中药材真伪优劣进行鉴别, 又可以对特定的指标性成分进行快速准确的定量分析。笔者等就近年来红外光谱法在中药当归质量研究方面应用概况进行综述和讨论。
1 红外光谱的工作原理及特点
1.1 红外光谱工作原理
 
红外光谱 (IR) 是由分子振动能级的跃迁同时伴随转动能级跃迁而产生的。物质吸收红外光应满足两个条件, 即辐射应具有刚好能满足物质振动能级跃迁时所需的能量;辐射与物质之间有耦合作用。因此, 当一定频率的红外光照射分子时, 如果分子中某个基团的振动频率与其一致, 同时分子在振动中伴随有偶极矩变化, 这时物质的分子就产生红外吸收。利用物质对红外光区的电磁辐射的选择性吸收来进行结构分析及对各种吸收红外光的化合物进行定性和定量分析。红外光谱仪主要分为色散型红外光谱仪和傅里叶变换红外光谱仪。色散型的单色器为棱镜或光栅, 属单通道测量。傅里叶变换红外光谱仪是非色散型的, 其核心部分是一台双光束干涉仪。当仪器中的动镜移动时, 经过干涉仪的两束相干光间的光程差就改变, 探测器所测得的光强也随之变化, 从而得到干涉图, 经过傅里叶变换的数学运算后, 就可得到入射光的光谱。
 
人们习惯上将红外光谱区划分为3个区, 即近红外区 (11 000~4 000 cm-1) 、中红外区 (4 000~400 cm-1) 和远红外区 (400~10 cm-1) 。当然, 这3个区间也没有严格的界限。这是由于不同的红外光谱仪所使用的光学元器件不同, 使红外光谱测量区间不完全相同。通常说的红外光谱指中红外光谱, 因为中红外区的光谱包含的光谱信息最多[7]。中红外光谱属于分子的基频振动光谱, 多用于样品的定性分析;近红外光谱主要是由分子振动的非谐振性使分子振动从基态向高能级跃迁时产生的, 记录的主要是含氢基团C-H、N-H、O-H、S-H、P-H等振动的倍频和合频吸收, 可对样品进行定性分析, 多用于定量分析, 但有谱带重叠多、吸收强度低等缺点, 在定量分析中必需在一定波段内利用化学计量学方法建立数学模型, 才能确定成分含量与光谱间的关系;远红外光谱为分子的转动光谱和某些基团的振动光谱[8-10]。
 
由于红外光谱产生的数据维数很高, 对其谱图的解析和分析需要结合相关的模式识别方法, 包括利用平滑、微分、基线漂移扣减、标准正态变换、多元信号校正、小波变换等方法处理原始红外光谱, 提高谱图的信噪比、改良分析信号的质量;利用主成分分析 (PCA) 、偏最小二乘法 (PLS) 、判别分析法 (DA) 、多元线性回归 (MLR) 、人工神经网络 (ANN) 和拓扑 (TP) 等校正方法处理红外光谱数据, 可以迅速而准确地鉴别中药、定量分析中药有效成分。
1.2 红外光谱分析技术的特点
 
红外光谱分析技术与其与传统分析技术相比, 有以下诸多优点: (1) 快速。通常1个样品分析时间不到1 min, 可以满足生产过程中实时监控的要求; (2) 制样简单。样品一般无需复杂处理, 不用化学试剂, 分析费用低, 且不污染环境; (3) 完成1次样品光谱采集, 即可实现多项性能指标的测定; (4) 经定标建模后, 无须用其他常规化学分析手段; (5) 使用光纤可实现远程分析检测; (6) 具有较高的精确度, 结果准确度逼近标准方法等优点[12]。同时, 红外光谱技术也有其局限性:用化学计量学等方法建立数学模型时, 需要收集大量具有代性的标准样品, 应用化学分析测定数据, 再通过计算机建立数学模型, 预测未知样品的结果, 故模型的建立需耗费大量的人力、物力和财力[13]。
2 红外光谱在中药当归质量研究中的应用
2.1 中红外光谱在中药当归质量研究中的应用
 
田进国等[14]对不同产地、品种当归的石油醚、乙醚和水提取物进行红外光谱分析, 结果不同产地、品种的当归分别具有各自很好的光谱特征, 根据其光谱特征可以准确地予以鉴别。娄雅静等[15]利用傅里叶变换红外 (FTIR) 光谱法并结合二阶导数谱对当归与硫磺熏蒸当归的醇提物和水提物进行对比分析, 结果显示, 当归经硫磺熏蒸后, 其红外光谱图与非熏当归红外光谱图中的特征吸收谱带峰型及峰的位置存在明显差异, 该研究所建立的方法可以鉴别硫熏与非熏当归, 具有实用意义和良好应用前景。吕光华等[16]采用红外光谱法, 并结合二维相关分析技术分析鉴别了来自甘肃岷县的两批当归药材各自的归头和归尾, 结果发现, 红外的一维谱图上较为相似, 而二维相关红外谱的不同而可方便的加以区分鉴别。该法快速、准确, 可为鉴别药用植物的不同部位和研究其化合物结构的变化规律提供一种新的方法和手段。潘新波等[17]采用FTIR及其二阶导数谱对对不同生长年限当归药材红外谱图的变化进行分析, 结果表明, 由于生长时间不同, 导致当归药材的化学成分存在差异, 体现了各自的红外特征谱, 其中第3年当归药材与第1年和第2年当归药材间差异较大, 为揭示当归药材生长代谢过程的变化规律提供科学依据。郭怡祯等[18]利用水蒸气蒸馏结合水提取的方法将当归中的化学成分提出, 并使用FTIR及二阶导数谱对当归原药材及不同提取物进行分析鉴定, 结果当归水提取物中主要含有当归多糖等物质, 而蒸馏液的乙醚提取物中则多为内酯类成分。先蒸馏再水提药的优化工艺, 能得到更多的脂溶性成分, 可提取出更多的当归多糖等水溶性成分, 更高效地利用了药材。该研究为中药当归鉴定和制定质量标准提供一种新的方法和手段, 为药材整体质量监控提供一定的理论依据。纪鹏等[19]在FTIR的基础上, 运用离散小波变换方法 (DWT) 进行分解, 然后采用BP神经网络对当归及其不同炮制品多糖进行有效的分类, 结果可行性较高。这种傅里叶变换红外光谱快速无损鉴别当归及其不同炮制品多糖的新方法, 为当归及其不同炮制品多糖的鉴别提供了依据, 从而为中药有效成分的鉴别奠定了基础。李四海等[20]使用正交信号校正及小波压缩 (OSCW) 对原始FTIR信号进行预处理, 然后对经过预处理后的光谱信号分别进行PCA和PLS分析, 比较无监督和有监督的模式识别方法的聚类分析, 结果PLS其效果明显好于PCA, 其聚类结果与当归的生长期呈现出较强的相关性, 生长期相近的当归在聚类图上的位置也接近, 该研究对当归药材生长过程中化学成分含量的动态变化具有一定的借鉴意义。孙元琳等[21]采用0.05 mol/L、0.20 mol/L和0.50 mol/L三氟乙酸和内切-α- (1→4) -聚半乳糖醛酸酶对当归多糖ASP3进行部分酸水解和酶水解, 并结合GC、FT-IR等方法对其水解产物的组成和红外光谱特征进行分析。实验表明, 当归多糖ASP3是一种果胶多糖, 主要由光滑区 (半乳糖醛酸聚糖) 和毛发区 (富含中性糖侧链的鼠李半乳糖醛酸聚糖) 两部分组成。Gal A和Rha位于多糖分子的主链, 大部分Gal A相连形成半乳糖醛酸聚糖光滑区;Gal、Ara、Man及Glc位于多糖分子的支链, 其中Gal以较高的聚合度与主链相连, Ara以还原性末端或低聚寡糖的形式与主链相连或与半乳聚糖末端相连形成阿拉伯半乳聚糖。孙元琳等[22]还应用傅里叶变换红外光谱仪对果胶多糖的酯化度 (DE) 进行快速定量分析, 建立了DE与A1730/ (A1730+A1630) 之间的线性回归方程, 相关系数为0.985 2, 表明果胶多糖的DE与其在1 730 cm-1和1 630 cm-1处的吸收峰面积之间有良好的线性关系, 与传统的化学滴定法相比, FTIR测定果胶多糖酯化度具有可行性, 可成为替代化学滴定法的一种的快速易行、准确的方法。
2.2 近红外光谱在中药当归质量研究中的应用
 
李波霞等[23]采用光纤漫反射采集近红外光谱对光谱进行PCA分析, 首次结合随机森林研究当归的分类模型, 建立了一种可快速准确判定当归产地、产期的质量控制方法, 为实现对当归的快速识别提供依据。刘黎锋等[24]采用多种光谱预处理方法、波长选择方法结合偏最小二乘法对当归提取液的光谱图与阿魏酸的含量进行关联拟合, 结果建立的阿魏酸NIR校正模型的预测能力较好, 预测结果与HPLC结果基本一致。该方法可以为当归提取过程、当归配方颗粒等工艺的在线质量控制提供有力的研究基础。顾志荣等[25]首先采用RP-HPLC-DAD测定当归药材中Z-藁本内酯、正丁烯基苯酞、阿魏酸和亚油酸的含量, 然后通过载有积分球漫反射装置的近红外光谱仪获得当归药材的近红外光谱, 对近红外光谱区域的特征吸收进行实验研究, 在此基础上利用TQ-Analyst8.0软件的偏最小二乘法建立定量模型, 实现当归药材中这四种成分含量的快速测定。该法样品预处理简单、操作简便、快速无损、准确可靠, 可以节省大量的分析时间, 特别适合大量样品快速测定。张亚亚等[26]使用采集甘肃及云南共14个主产县的96批当归样本, 采用相似度分析和偏最小二乘判别分析 (PLS-DA) 研究当归不同药用部位的近红外漫反射光谱指纹图谱特征。研究表明, 当归不同药用部位中有近红外吸收的化学成分含量大小依次为归身>归尾>归头>全归, 说明当归不同部位化学成分具有一定的差异, 为当归不同部位入药研究提供一定的参考。张亚亚等[27]还用反相高效液相色谱二极管阵列检测器 (RP-HPLC-DAD) 测定的正丁基苯酞含量为化学参考值, 以积分球漫反射方式扫描NIR, 采用偏最小二 (PLS) 法建立建立一种快速测定当归中正丁基苯酞含量的方法。该方法特别适合大批量药材中有效成分或指标性成分的快速测定, 在中药质量控制中具有广阔的发展前景。王耀鹏等[28]通过载有积分球漫反射装置的近红外光谱仪测定12个产地共130批当归药材的近红外光谱, 以原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱法测定相应的产地土壤中15种矿质元素的质量分数, 采用灰色关联度及多元非线性回归分析当归NIR光谱特征与土壤矿质元素的关联程度。结果当归化学成分的多种基团与土壤矿质元素关系密切, 土壤中多种矿质元素与当归NIR指纹图谱的关联表现出多重性及交互性, 该研究对于当归药材的优质栽培具有一定指导意义。Woo等[29]采用NIR技术对分别来自中国和韩国的当归进行了无损快速鉴别, 鉴别准确率为100%。
2.3 远红外光谱在中药当归质量研究中的应用
 
沈亚芬[30]以甘肃、云南等不同产地的中药材当归、党参为研究对象, 进行MIR分析, 建立两种药材的红外光谱指纹图谱, 并对药材中的重金属含量进行测定。结果不同产地当归、党参药材的主要化学特征极为相似, 16份当归药材样品与14份党参药材样品中的重金属含量均符合相关限量规定。但由于样本地域范围较窄, 使得样品种类较单一, 采集数量较少, 因此, 对于两种中药的质量评价标准的建立仍需进行进一步的探讨和研究。孙宇靖等[31]将当归样品用远红外增效保鲜盒保存一周后, 用高效液相色谱法对保存前后的当归样品进行含量测定。结果远红外增效保鲜盒保存后样品的化学成分的组成并无变化, 但弱极性成分含量有明显增加。
3结语
 
传统的中药分析方法鉴别难度较大, 并且需要对药材进行破坏性的预处理, 为避免其成分间的相互干扰, 还需对其化学成分进行提取、分离等操作, 耗时较长, 药材损耗量大。红外光谱分析技术能够以无损的方式从样本中直接获取分析信息, 并借助于聚类分析、主成分分析、偏最小二乘判别分析等化学计量学的方法进行系统研究, 对于药材的定性鉴别、质量控制具有十分重要的科学意义和实用价值。建议在已有的研究工作基础上, 进一步不断创新化学计量学方法和开发相应软件, 充分挖掘红外光谱技术在中药质量分析领域方面的应用潜力, 相信红外图谱的解析会越来越简单。